Метод агглютинации в геле для определения антигенов эритроцитов и антиэритроцитарных антител
Метод агглютинации в геле для определения антигенов эритроцитов и антиэритроцитарных антител
Введение
Гелевая технология в микропробирках (ГТМ) была предложена Y. Lapierre в 1989 г. Метод основан на агглютинации эритроцитов в агаровом геле "сефадекс", помещенном в микропробирки. Обычно система представляет собой пластиковые карты, содержащие микропробирки, заполненные гелем (патент DiaMed AG, Швейцария). Иммуногематологические исследования, основанные на реакции гемагглютинации, обычно проводятся в жидкофазных системах.
Одним из наиболее важных условий получения корректных данных реакции агглютинации является оценка результата. Слабая реакция может быть неверно интерпретирована, особенно неопытным персоналом. Ложные слабые или отрицательные результаты непрямого антиглобулинового теста могут иметь место за счет нейтрализации антиглобулинового реагента следами сыворотки вследствие недостаточно эффективного отмывания эритроцитов. Неадекватное перемешивание эритроцитов и элюция слабофиксированных антител в процессе отмывания могут стать причиной ошибок при проведении непрямого антиглобулинового теста.
Англоязычные термины, встречающиеся при описании идентификационных карт | |||
АНG | - античеловеческий глобулин | LISS | - раствор низкой ионной силы |
Confirmation | - подтверждение, подтверждающий тест | Neg | - негативный (отрицательный) |
Coombs | - Кумбс | Newborns | - новорожденные |
Ctl | - контроль | Phenotype | - фенотип |
Dia Clon | - моноклональные антитела | Pos | - позитивный (положительный) |
Enzyme | - фермент | Subgroups | - подгруппы |
Методика агглютинации в геле была разработана с целью стандартизации реакций гемагглютинации и получения достоверных результатов. Гелевая технология предусматривает разделение эритроцитов при центрифугировании, при этом неагглютинированные эритроциты проходят через гель и оседают на дне пробирок (отрицательный результат), в то время как агглютинированные задерживаются на поверхности или в толще геля (положительный результат). Центрифугирование в геле может быть конечной фазой любых серологических исследований, основанных на реакции гемагглютинации, кроме методов, требующих диспергирования для оценки результата.
Диапазон выполняемых тестов включает в себя определение фенотипа эритроцитов (включая слабые варианты антигенов), антиглобулиновый тест, скрининг и идентификацию антител, тесты на совместимость и некоторые другие.
Принцип гелевого теста
Забуференный декстрановый гель SephadexТМ G 100 superline может быть как нейтральным, так и содержащим специфические антисыворотки или антиглобулиновый реагент на гелевом матриксе. На гель наносятся эритроциты или смесь эритроцитов и сыворотки. Клетки всегда вносятся перед сыворотками - в отличие от стандартных серологических методик - с тем, чтобы тестируемые сыворотки не контактировали с гелем, что особенно важно при проведении антиглобулинового теста. После инкубации следует центрифугирование в строго определенном режиме. Если условия центрифугирования не выполняются (центрифугирование недостаточно длительное или слишком мягкое) могут иметь место ложноположительные результаты. Ложноотрицательные результаты также могут иметь место при нарушении условий (форсировании) центрифугирования. Использование автоматической ID-центрифуги (ДиаМед) устраняет эти проблемы. Для проведения тестов обычно используются три вида геля:
- нейтральный, не содержащий специфических антител (применяется для поиска и идентификации антител солевым, и ферментным методами, холодовой стадии пробы на совместимость крови донора и реципиента);
- специфический, содержащий антитела (моноклональные или поликлональные) к антигенам эритроцитов крови человека (применяется для типирования антигенов эритроцитов систем АВО, Резус, Келл и т.д.)
- антиглобулиновый, содержащий антитела (полиспецифические или моноспецифические) к иммуноглобулинам человека и компонентам системы комплемента (применяется для прямого и непрямого антиглобулинового теста (реакции Кумбса) при поиске и идентификации ауто- и аллоиммунных антител, пробе на совместимость крови донора и реципиента).
Исследуемая кровь добавляется в верхнюю часть микропробирок диагностических карт, и при центрифугировании осуществляется разделение агглютинированных и неагглютинированных эритроцитов следующим образом: неагглютинированные эритроциты имеют размер, сравнимый с размером частиц геля и свободно проходят сквозь них под действием центробежной силы, формируя на дне микропробирки компактный осадок красного цвета - отрицательный результат; агглютинированные эритроциты ввиду больших размеров задерживаются на поверхности геля или в его толще - положительный результат.
Фиксированная агглютинация в геле позволяет легко оценивать результат реакции, а наличие контрольной микропробирки в диагностической карте подтверждает достоверность полученных данных.
В зависимости от силы реакции агглютинации в гелевой среде принята следующая оценка полученных результатов:
- сильноположительный (++++) - образовавшиеся агглютинаты эритроцитов задержались на поверхности геля;
- положительный (+++) - агглютинаты располагаются в верхней трети столбика геля;
- слабоположительный (++) - агглютинаты фиксированы в верхних двух третях геля;
- очень слабоположительный (+) - агглютинаты располагаются в нижней трети геля;
- отрицательный (-) - эритроциты формируют на дне микропробирки компактный осадок.
Оборудование и реактивы
- ID-карты для определения антигенов эритроцитов и антиэритроцитарных антител;
- ID-центрифуга для центрифугирования карт;
- термостат на +37°С;
- штатив для пробирок и карт;
- пробирки вместимостью 5 и 10 мл;
- пипетки полуавтоматические одноканальные (10, 25, 50 мкл);
- перчатки резиновые хирургические;
- раствор для разведения 1 (раствор бромелина);
- раствор для разведения 2 (раствор низкой ионной силы - LISS, РНИС);
- 0,9% раствор хлорида натрия;
- стандартные типированные эритроциты человека для выявления антител и проведения перекрестной реакции.
Характеристика идентификационных карт
Идентификационные карты (ID-карты) Диа-Мед представляют собой пластиковые карточки, в которые встроено по шесть микропробирок. В пяти пробирках содержится смесь геля и антисывороток. Каждая карточка имеет шестую контрольную пробирку, содержащую нейтральный гель без антител (сtl). Маркировка пробирок в ID-карте осуществляется по выявляемым антигенам, например: А-В-АВ-D-СDЕ-сtl или С-с-Е-е-К-ctl. Идентификационные карты для выявления антител к антигенам эритроцитов имеют некоторые отличия, например, карты "Coombs / Enzyme Test": в трех пробирках, расположенных слева, содержится гель, содержащий антитела к глобулинам человека (моноспецифические анти-IgD или полиспецифические - к иммуноглобулинам различных классов) - реакция Кумбса. В следующих трех пробирках содержится только нейтральный гель, предназначенный для выявления антител к антигенам эритроцитов в солевой среде.
Общие правила использования идентификационных карт
- Идентификационные карты должны храниться в сухом, защищенном от света месте при температуре 18-25°С. Срок годности указан в паспортной части каждой карты и на упаковочных коробках.
- Растворы для приготовления суспензии эритроцитов, а также стандартные сыворотки и стандартные ID-эритроциты, использующиеся в отдельных исследованиях, должны храниться в сухом, защищенном от света месте при температуре 2-8°С. Срок годности указан на этикетке каждого флакона и упаковочной коробке.
- Во избежание получения ложных результатов исследований, запрещается использование любых реагентов и карт с истекшими сроками годности, а также высохших, содержащих пузырьки газа или при повреждении оболочки.
- Заготовка крови осуществляется с применением современных флеботомических методик, а также пригодна артериальная, капиллярная и пуповинная (без отмывания) кровь. Для исследований пригодны как образцы цельной крови (взятые в чистую, сухую пробирку), так и образцы крови, взятые на консервантах и стабилизаторах.
Типирование антигенов эритроцитов
ID-карты ДиаМед предназначены для одновременного определения группы крови по системе АВО и резус-принадлежности эритроцитов доноров и реципиентов (включая их слабые варианты антигенов), а также для типирования других антигенов эритроцитов. ID-карты ДиаМед можно использовать взамен или параллельно с изогемагглютинирующими сыворотками, реагентами анти-D, анти-DСЕ, цоликлонами анти-А, анти-В, анти-D и анти-D Супер.
- Алгоритм проведения исследований [показать] .
- Дальнейшие действия [показать] .
Используемые ID-карты
При определении групп крови и резус-принадлежности применяют поликлональные (табл. 18.10 [показать] ) и моноклональные (табл. 18.11 [показать] ) реагенты. Наиболее частое применение на практике вследствие экономической целесообразности находят моноклональные сыворотки.
По современной классификации лица с ослабленным вариантом антигена D, способные вырабатывать анти-D-антитела, подразделяются на семь категорий. Наибольшую частоту встречаемости и практическое значение имеет категория VI, эритроциты которой несут только эпитоп Z антигена D. Лица категории VI (резус-отрицательные реципиенты, но резус-положительные доноры!) могут вырабатывать антитела к неизмененному D и частичному D всех остальных категорий. Для подтверждения группы крови используют различные ID-карты: D(IV–) - для реципиентов, D(IV+) - для доноров.
Определение группы крови АВО и резус-принадлежности проводят путем идентификации специфических антигенов и антител (двойная или перекрестная реакция) (табл. 18.12 [показать] ).
Для углубленного обследования используют другие карты (табл. 18.13-18.14 [показать] ).
Выявление антиэритроцитарных антител
Принцип метода
Исследуемые сыворотки и стандартные эритроциты для выявления антител добавляются в верхнюю часть микропробирок. После инкубации и центрифугирования агглютинированные эритроциты остаются в верхней части пробирки, так как не проходят через гель из-за большого размера агглютинатов (положительный результат). При отсутствии антител к антигенам тест-эритроцитов агглютинаты не образуются. Неагглютинированные эритроциты легко проходят через гель и оседают на дне пробирки (отрицательный результат). Характер агглютинации при выявлении антител к эритроцитам зависит от титра антител, их активность и оценивается от ++++ до +.
- Алгоритм проведения исследований [показать] .
- Интерпретация результатов [показать] .
Скрининг и идентификация антител
Скрининг антител выполняется как в нейтральном геле, так и в геле, содержащем антиглобулиновый реагент (табл. 18.15-18.16 [показать] ). В первом случае для исследования используются обработанные ферментом эритроциты, во втором - суспензия эритроцитов в растворе низкой ионной силы. Скрининг и идентификация антител производятся с помощью стандартной панели эритроцитов. При оценке эффективности гелевого теста для скрининга и идентификации антител была установлена его более высокая чувствительность по сравнению с традиционными методиками.
Методы исследования антител к антигенам эритроцитов
- Антиглобулиновый тест (непрямая реакция Кумбса) [показать] .
- Ферментный метод [показать] .
- Метод холодовой агглютинации [показать] .
Определение совместимости крови донора и реципиента
Целью пробы на индивидуальную совместимость является предотвращение трансфузий гемокомпонентов, несовместимых по антигенам эритроцитов. Тестирование сыворотки реципиента с эритроцитами предполагаемого донора - наиболее надежный способ выявления антител, способных вызвать повреждение перелитых эритроцитов, посттрансфузионные реакции и осложнения гемолитического типа. Проведение такой пробы позволяет:
- подтвердить АВО-совместимость донора и реципиента;
- выявить антитела в сыворотке реципиента, направленные против антигенов эритроцитов донора.
Тестирование на индивидуальную совместимость крови донора и реципиента по антигенам эритроцитов(табл.18.17 [показать] ) не заменяет обязательное имуногематологическое исследование (типирование антигенов эритроцитов систем АВО, Резус, Келл, выявление антиэритроцитарных антител, поиск и идентификацию аллоантиэритроцитарных антител), а лишь дополняет его.
Ввиду того, что сенсибилизация может появиться даже после трансфузий индивидуально подобранных гемокомпонентов, для проведения проб на совместимость необходимо использовать каждый раз свежую сыворотку пациента, полученную после последней трансфузии гемокомпонентов.
Проба на совместимость должна быть проведена для каждого образца крови донора!
- Ход определения [показать]
- Результаты пробы на совместимость (4, 5 микропробирки) [показать]
- Ограничения [показать]
- Условия хранения и эксплуатации [показать]
Заключение
Гелевый тест является простым, воспроизводимым, быстрым и очень чувствительным методом, позволяющим сразу выявлять слабые варианты антигенов эритроцитов. Тест оценивается только макроскопически. После короткого обучения персонала, необходимого для правильного выполнения теста, сводятся к минимуму затраты рабочего времени и ошибки, встречающиеся при использовании традиционных методик.
Гелевый тест позволяет стандартизировать лабораторные методики, дать объективную оценку результатов реакции гемагглютинации. Стабильность результатов теста позволяет перепроверять полученные данные, что необходимо для контроля. Результаты теста могут быть фотокопированы для сохранения их в архиве или для учебных целей в сложнодиагностируемых случаях. Для теста используется небольшое количество сыворотки или эритроцитов, что чрезвычайно важно для педиатрических клиник.
Использование гелевой системы позволяет снизить риск заражения персонала даже при работе с потенциально инфицированными образцами. Гелевый тест может быть использован для проведения проб на совместимость по антигенам эритроцитов перед переливанием крови. Для этого используются непрямой антиглобулиновый тест и одностадийный ферментный метод.
Гелевый тест выполняется и оценивается по выше приведенным правилам. Отсутствие этапов отмывания эритроцитов при выполнении непрямого атиглобулинового теста позволяет более эффективно использовать рабочее время, а также благодаря стабильности результатов теста контролировать все полученные результаты.
Источник: Медицинская лабораторная диагностика, программы и алгоритмы. Под ред. проф. Карпищенко А.И., СПб, 2001